Hitra in napredna metoda za analiziranje večjih nukleinskih kislin s Slalom kromatografijo
mRNA terapevtiki predstavljajo raznolik portfolio za razvoj cepiv in imunoterapij na področju raka in »protein replacement« terapij. Ključen korak pri sintezi mRNA je in vitro transkripcija (IVT), proces, ki tvori enoverižno mRNA iz molekule DNA. Medtem ko je encimski proces IVT učinkovit, pa povzroči nastanek dvojnovijačne RNA. Le ta je neželen stranski produkt, ki je kontaminant in ogroža varnost ter učinkovitost končnega produkta, terapija s takim kontaminantom pa lahko sproži neželeno aktivacijo imunskega sistema, tudi če je prisoten v zelo nizkih koncentracijah.
Zelo pomembno je, da se pri laboratorijskih analizah poslužujemo tehnik, ki so zelo občutljive in lahko določijo tako nukleinske kisline kot kontaminante v majhnih koncentracijah.
Določevanje nukleinskih kislin z gelsko elektroforezo je rutinsko, vendar rezultat analize pogosto ni dovolj občutljiv, da bi zaznal nizke koncentracije motečih komponent. Po drugi strani, če želimo vzorce analizirati z občutljivo metodo, kot je npr. ELISA, ki deluje na principu določanja dsRNA-specifičnih protiteles, nam to vzame več časa, saj je pri tej analizi potrebnih več korakov.
Težava nastane, kadar je potrebno izvesti analizo velikega števila vzorcev v kratkem času, kar lahko povzroči neželene napake. Prav tako je metoda dot-blot časovno potratna in ni dovolj zanesljiva, saj lahko dobimo lažno pozitivne rezultate zaradi ne-specifične adsorbcije na membrano. V takih primerih je analizo potrebno ponoviti, kar v laboratoriju povzroči dodatno časovno obremenitev ter poveča porabo laboratorijskega materiala. Zaradi teh pomanjkljivosti je podjetje Waters zasnovalo alternativo agarozni gelski elektroforezi in kapilarni gelski elektroforezi, ki se v praksi uporabljata, z namenom izboljšanja zanesljivosti in ponovljivosti analiziranja večjih molekul nukleinskih kislin s HPLC sistemom.
Kaj je slalom kromatografija?
Slalom kromatografija je bila prvič uporabljena leta 1988 za analiziranje dvojnovijačnih DNA molekul, vendar se, zaradi takratnih izzivov, kot so bili slaba čistost delcev, velika izguba vzorca in slaba retencija, ni razvijala, vse do sedaj. S hitrim razvojem celičnih linij, genskih terapij in bioinertne visokotlačne tekočinske kromatografije (UHPLC), je slalom kromatografija ponovno doživela razcvet.
Katero analitsko opremo potrebujemo za slalom kromatografijo?
Za slalom kromatografijo potrebujemo UHPLC ali UPLC sistem in primerno »GtxResolve slalom« kolono, ki je narejena posebej za ta tip analize, saj mora prenesti visoke tlake in visoke pretoke pri kateri se izvaja analiza.
Ker se s slalom kromatografijo analizirajo nukleinske kisline, ki vsebujejo komponente, občutljive na kovino, je Waters zasnoval rešitev, ki zmanjšuje adsorbcijo komponent iz vzorca na kovinske ione ohišja kolone v obliki »Hydrophilic High Performance Surface – HPS« slalom kolon in sistema Arc Premier (UHPLC), Acquity Premier (UPLC) ali Alliance iS Bio, pri katerih so vse kapilare v sistemu zasnovane s HPS tehnologijo, saj prihajajo biomolekule v stik s kovino po celotnem sistemu, ne le v koloni. S tem je občutljivost analiz bistveno boljša, kot če bi uporabljali le bioinertno kolono z neinertnim sistemom. Prav tako pa so vsi trije sistemi primerni za dovolj visok tlak, ki je pri slalom kromatografiji bistvenega pomena (> 9500 psi).
Kako poteka slalom kromatografija?
Slalom kromatografija predstavlja rešitev na področju ločbe večjih nukleinskih kislin. Slalom kromatografija se lahko uporablja za številne analitske namene pri analizi nukleinskih kislin upoštevajoč njihovo obliko, dolžino in vrsto nukleinske kisline. Pri analizi se molekule v koloni raztegujejo in krčijo zaradi kinetskih sil, ki nastajajo, in s tem omogočijo njihovo ločbo. Pri tej tehniki je zaporedje elucije ravno nasprotno od hidrodinamske kromatografije, torej se večje DNA molekule dlje zadržijo v koloni v primerjavi z manjšimi, ki se eluirajo kasneje. Slalom kromatografija je dobila ime po olimpijskem športu slalom, pri katerem smučarji vijugajo med ovirami.
V koloni molekule nukleinskih kislin, pri potovanju od začetka proti koncu kolone, potujejo mimo ovir in s tem ustvarjajo t.i. »slalom«. Bolj fleksibilne molekule, kot so enoverižna RNA, se gibajo med ovirami bolj lahkotno in hitreje, zato se zato eluirajo najprej. Nasprotno pa imajo večje molekule, kot je dvojnoverižna RNA, večjo težavo pri manevriranju med ovirami, saj se zaradi svoje velikosti v njih zaletijo, kar jih upočasni. Večje molekule se torej eluirajo kasneje.
Pri slalom kromatografiji ni pomembno le gibanje molekul oz. ločevanje glede na velikost, temveč dejstvo, da molekule ohranijo podaljšano obliko kljub visokim strižnim silam, ki nastanejo pod visokim tlakom in hitrim pretokom. Za slalom kromatografijo so primerne dvojnoverižne molekule RNK in DNK, ki so večje od 4 kbp.
Premikanje molekul v slalom koloni pod drobnogledom:
Slalom kromatografija: nov pristop ter primerjava z gelsko elektroforezo
Pri tradicionalni metodi analiziranja nukleinskih kislin z gelsko elektroforezo gre za premikanje nabitih delcev v zamreženem gelu pod vplivom električnega polja. Ker ima DNA molekula električni naboj se lahko v gelu loči glede na velikost, saj gel ovira potovanje težjih molekul. Pri HPLC slalom kromatografiji pa gre, kot smo že zgoraj opisali, za ločbo nukleinskih kislin na podlagi kinetskih sil.
Da bi primerjali učinkovitost slalom kromatografije in gelske agarozne elektroforeze, si poglejmo primerjavo obeh tehnik z lestvico 0,5 µg nukleinskih kislin 23 kbp dsDNA, ki je vsebovala fragmente velikosti 2; 2,3; 4,3; 6,5; 9,4 in 23 kbp, pri uporabi 1× TAE pufra, pri pretoku 1,30 mL/min, tlaku 10.820 psi in temperature 40 °C. Komponente vzorca smo spremljali na podlagi njihove absorbance pri valovni dolžini 260 nm.
Rezultate ločbe posameznih komponent dsDNA, zabeležene na slalom koloni GTxResolve 250 Å (4,6 × 300 mm) smo primerjali z rezultati, dobljenimi z agarozno gelsko elektroforezo (slika 1).
S slalom kromatografijo uspešno ločimo nukleinske kisline večje od 4 kbp v 3,5 minutah
Medtem ko so bili fragmenti dsDNA z velikostjo < 4 kbp na agaroznem gelu dobro ločeni, je bila ločljivost večjih fragmentov (> 4 kbp) izrazito boljša na koloni GTxResolve 250 Å, pri čemer smo opazili 4,5-kratno izboljšanje v ločljivosti pri fragmentih od 9,4 do 23 kbp. Ti rezultati jasno potrjujejo primernost in uporabnost slalom kromatografije za analizo velikih dsDNA molekul, večjih od 4 kbp. Prav tako je čas ločbe pri slalom kromatografiji bistveno krajši 3,5 min v primerjavi s tradicionalno elektrofozero, pri kateri porabimo 60 minut.
Pogosto agarozni geli zahtevajo dodatne korake optimizacijo. Na primer, priporočeni pogoji s strani proizvajalca morda ne bodo dali pričakovanega števila profilov. Za doseg optimalnega in vsaj delno ponovljivega rezultata je pogosto potrebno prilagoditi delež agarozne mase, obdelavo vzorca in masno obremenitev z vzorcem. Ob tem pa napake pri pipetiranju povzročajo, da je ta tehnika bolj kvalitativna kot kvantitativna.
Slalom kromatografija, v primerjavi s tradicionalnimi metodami, kot je gelska elektroforeza, omogoča superiorno ločbo, resolucijo in učinkovitost detekcije v manj kot petih minutah, za večje nukleinske kisline od 4 kbp. Priprava HPLC sistema se bistveno ne razlikuje od priprave za kakšno drugo tehniko tekočinske kromatografije.
Prav tako je prednost slalom kromatografije, da za dobro ločbo zadostuje že majhna količina vzorca, kot je 10 ng.
Z uvedbo slalom kromatografije lahko analizirate večje nukleinske kisline z najsodobnejšo tehniko, »in-house znanjem« in zaupanjem v ponovljive in dobro občutljive rezultate Waters opreme.
Slalom kolone prilagojene na robustnost s prilagojeno stac. fazo in kovinskim ohišjem
Ker si pri laboratorijskem delu želimo čim bolj zmanjšati nepotrebne stroške, je življenjska doba kolone še kako pomembna. Slalom kromatografija se izvaja pri visokih tlakih (npr. 10.750 psi), visokih pretokih (npr. 1,3 mL/min) in visokih temperaturah (40 °C). Ker so molekule pri nižji temperaturi bolj viskozne, lahko pride do povišanja tlaka, zato je priporočljiva ustrezna prilagoditev temperature v koloni. Zaradi pogojev dela je stacionarna faza slalom kolon prilagojena na odlično robustnost, inertnost, izkoristek, ločljivost in ponovljivost med posameznimi proizvodnimi serijami kolone.
Inertnost kovinskega ohišja »Hydrophilic High Performance Surface – HPS« prispeva k boljšemu izkoristku, ponovljivosti in ločbi, saj se zmanjša adsorbcija problematičnih komponent iz vzorca na kovinske ione ohišja kolone.
Varnost zaposlenih pri analiziranju nukleinskih kislin
Prednost slalom kromatografije je, da za uspešno analizo ni potrebnih toksičnih reagentov, kot so etidijev bromid, akrilamid, fenol in kloroform.
Slalom kromatografija je hitra in zelo občutljiva UHPLC/UPLC rešitev za zaznavanje večjih molekul nukleinskih kislin in dsRNA kontaminant v mRNA terapevtikih, ki nastajajo pri in vitro transkripciji. V primerjavi z agarozno gelsko elektroforezo, slalom kromatografija zagotavlja bistveno boljšo ločbo velikih nukleinskih kislin (> 4 kbp), do 4,5-krat boljšo resolucijo večjih dsDNA fragmentov, zelo kratek čas analize (≈ 3,5 min) namesto ~60 min ter visoko občutljivost že pri 10 ng vzorca, ob hkrati boljši ponovljivosti in kvantitativnosti. Metoda je robustna, slalom kolone imajo dolgo življenjsko dobo, obenem pa je tehnika varnejša za laboratorijsko osebje, saj ne zahteva uporabe toksičnih reagentov, kot so etidijev bromid, akrilamid, fenol ali kloroform.
Avtorica članka je Simona Ribizel, prodajna predstavnica v podjetju Labtim, ki se pri svojem delu osredotoča na podporo laboratorijem pri izbiri in optimizaciji potrošnega materiala ter reševanju praktičnih izzivov v analitskih procesih.
VIRI:
- Retention mechanism in combined hydrodynamic and slalom chromatography for analyzing large nucleic acid biopolymers relevant to cell and gene therapies https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021967324004497
- Theoretical predictions to facilitate the method development in slalom chromatography for the separation of large DNA molecules https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021967324007532
- Gel elektroforeza
http://www-f1.ijs.si/~rudi/sola/seminar-Parkelj.pdf - Gel Electrophoresis Safety
https://www.safety.rochester.edu/ - A New Alternative to Gel Electrophoresis: Higher Resolution and Faster Analysis of Large Nucleic Acids by Rigorously Designed GTxResolveTM 250 Å Slalom Columns
https://www.waters.com/nextgen/us/en/library/application-notes/2025/a-new-alternative-to-gel-electrophoresis-higher-resolution-and-faster-analysis-of-large-nucleic-acids-by-rigorously-designed-gtxresolve-250-slalom-columns.html - Rapid and Sensitive Detection of dsRNA Contaminants in mRNA Using the GTxResolve™ 250Å Slalom Chromatography Column
https://www.waters.com/nextgen/us/en/library/application-notes/2025/rapid-and-sensitive-detection-of-dsrna-contaminants-in-mrna-using-the-gtxresolve-250a-slalom-chromatography-column.html
OPOMBA: Vsebina članka je namenjena splošnemu informiranju in ni znanstvene narave. Pred uvedbo sprememb v delovne postopke priporočamo presojo skupaj z našo strokovno ekipo glede na specifične zahteve vašega laboratorija.
